Evaluación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, Q – PCR para la detección de Ralstonia solanacearum, SEQUEVAR 1.

Ruiz Chutan, José Alejandro (2013) Evaluación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, Q – PCR para la detección de Ralstonia solanacearum, SEQUEVAR 1. Other thesis, Universidad de San Carlos de Guatemala.

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Abstract

La presente investigación se realizó para evaluar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la detección de la marchitez bacteriana, que es es la principal enfermedad a nivel mundial, siendo Ralstonia solanacearum E. F. Smith, el agente causal de dicha enfermedad. Su gran variabilidad genética, hace que alrededor de 50 familias botánicas sean hospedantes de esta bacteria causando grandes daños en cultivos de interés económico a nivel mundial. Debido a las características de la bacteria, esta es capaz de sobrevivir sin ningún problema en tejido vegetal así como en suelo y agua. Gracias al avance que han experimentado las técnicas moleculares, actualmente se ha llegado a clasificar a la bacteria hasta el nivel de sequevar mediante la comparación de regiones de ADN específicas y muy conservadas como el gen de la endoglucanasa (Schaad 2001; Hayward 1964; Hayward 1991). Actualmente una de las herramientas más avanzadas en la detección de patógenos es la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, debido al alto nivel de fiabilidad en cuanto a especificidad y sensibilidad. Para llevar a cabo la evaluación de la técnica antes descrita se utilizaron muestras provenientes de tejido vegetal y suelo de plantaciones de papa y tomate escogidas mediante un muestreo dirigido para garantizar la presencia del sequevar 1 de la vi bacteria R. solanacearum. Las muestras de tejido vegetal, junto con agua estéril, fueron maceradas para obtener una suspensión, la cual fue utilizada para realizar la siembra de la bacteria en el medio Semiselectivo de Sudáfrica Modificado (SMSA) para lograr aislar la bacteria. Seguidamente, se identificaron las colonias que poseían las características típicas de la bacteria en estudio: consistencia lechosa, mucoide y blanquecina de coloración rojiza al centro. Las colonias identificadas como positivas se utilizaron para realizar una Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional empleando los cebadores 630 y 631 que son específicos para el sequevar 1 de la bacteria Ralstonia solanacearum, Por otra parte, de la misma suspensión utilizada para realizar la siembra de la bacteria en el medio SMSA, se tomó una alícuota para realizar el proceso de detección molecular del sequevar 1 de la bacteria, mediante el uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (Q-PCR) empleando los mismos cebadores utilizados para llevar a cabo el PCR convencional, más la adición de un agente intercalente que provocó una emisión fluorescente tras la formación de los amplicones. Finalmente, se determinó que la técnica de detección evaluada, PCR en tiempo real, es específica para la detección de la bacteria Ralstonia solanaceraum al nivel del sequevar 1, mostrando un 80% de efectividad en las detecciones realizadas, comparado con los resultados obtenidos mediante la técnica de PCR convencional a través de protocolos validados en otras investigaciones.

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